大连市两种来源副溶血性弧菌毒力基因的分析

来源：中国期刊网分类：医学发布时间：2022-03-11 浏览：0次

摘要：目的了解2017—2018年大连市两种不同来源的副溶血性弧菌主要毒力基因的分布差异。方法对2017—2018年大连市食品和患者两种来源共160株副溶血性弧菌用VITEK 2 compact全自动微生物鉴定系统进行生化鉴定，并检测不耐热溶血素基因（tlh）、耐热直接溶血素基因（tdh）、耐热相关溶血素基因（trh）、toxRS/new、orf8及Ⅲ型分泌系统（T3SS1、T3SS2α、T3SS2β）。结果 160株副溶血性弧菌经系统生化鉴定全部为副溶血性弧菌。两种来源菌株tlh、T3SS1携带率均为100%,trh携带率为0，携带率无差异；食品来源菌株的毒力基因T3SS2β携带率（1.20%）略高于患者来源菌株（0），差异无统计学意义（χ2=0.934,P>0.05）；食品来源菌株的toxRS/new携带率（10.84%）明显高于患者来源菌株（2.60%），差异有统计学意义（χ2=4.242,P<0.05）；食品来源菌株的tdh、orf8、T3SS2α的携带率（分别为8.43%、3.61%、19.28%）明显低于患者来源的菌株（分别为70.13%、25.97%、88.31%），差异均有统计学意义（χ2=64.452、16.224、76.336，均P<0.05）；食品来源菌株tdh-/trh-/orf8-/T3SS2α-/T3SS2β-比例（68.67%）明显高于患者来源菌株（6.49%），差异有统计学意义（χ2=65.071,P<0.05）；两种来源的菌株均不存在同时携带tdh/toxRS/new的菌株。结论 2017—2018年大连市食品和患者两种来源的菌株均不存在大流行菌株，都携带tlh和T3SS1，不携带trh；除toxRS/new外，食品来源的副溶血性弧菌毒力基因携带率明显低于患者来源的菌株。
关键词：大连副溶血性弧菌 毒力基因

副溶血性弧菌是一种革兰氏阴性弧菌，属于弧菌科、弧菌属，存在于近海海水及海产品中。除外伤引起的伤口感染及败血症，副溶血性弧菌最常见的是引起急性胃肠炎，其原因通常是人们生食或食用未充分煮熟的海产品。有研究显示，不同来源的副溶血性弧菌携带毒力基因差异较大，大部分环境分离株（包括食品分离株）缺少毒力基因[1]，不能导致实验动物腹泻，而临床分离株则能导致实验动物腹泻[2]；不同地区流行的副溶血性弧菌携带的毒力基因也有很大差别[3]。我们检测2017—2018年大连市食品和患者两种来源的副溶血性弧菌毒力基因，包括不耐热溶血素基因(tlh)、耐热直接溶血素基因（tdh）、耐热相关溶血素基因(trh)、toxRS/new、orf8及Ⅲ型分泌系统（T3SS1、T3SS2α、T3SS2β），分析两种来源菌株携带毒力基因的差异。

1 材料与方法

1.1 材料
1.1.1 实验菌株
收集2017和2018年大连市食品和患者来源的副溶血性弧菌共160株，其中食品来源菌株83株，主要是食品风险监测和食物中毒事件中从食品分离的菌株；患者来源菌株77株，主要是大连市食源性致病菌主动监测和食物中毒事件中从患者粪便分离的菌株。
1.1.2 主要的试剂与培养基
胰蛋白胨大豆琼脂（Tryptose Soya Agar,TSA）（北京陆桥技术股份有限公司，Lot No.180705),vitek2革兰氏阴性细菌鉴定卡（法国梅里埃，Lot No.2410915403),Taq酶（日本宝生物，Lot No.RR001A），引物由华大基因合成。
1.1.3 主要的设备
全自动细菌鉴定和药敏分析系统（法国梅里埃，VITEK2 Compact),PCR仪（美国伯乐，C1000 Touch Thermal cycler），毛细管电泳仪（美国凯杰，Qiaxcel）。
1.2 方法
1.2.1 生化鉴定复核
将待复核菌株接种至含3%氯化钠TSA,37℃培养24 h，复苏后用VITEK2 Compact全自动细菌鉴定系统进行生化鉴定。
1.2.2 毒力基因检测
用聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）方法检测毒力基因：tlh、tdh、trh、toxRS/new、orf8、T3SS1、T3SS2α及T3SS2β。核酸提取：菌株复苏后，接种于含3%氯化钠TSA平板，37℃培养24 h后，挑取单个菌落于200μL灭菌水中充分研磨，10 000 r/min、离心半径13.5 cm、离心5 min，弃去上清液，加入100μL裂解液99℃金属浴10 min,10 000 r/min离心5 min，上清即为DNA。PCR反应体系25μL,10×PCR缓冲液2.5μL,Taq DNA聚合酶0.25μL，脱氧核糖核酸（dNTP)2μL，引物（10μMol/L）各1μL,DNA模板1μL，加无酶H2O补充至25μL。tlh/tdh/trh按照国家食品安全风险评估中心提供的引物序列进行合成，其他引物按照文献[1-3]报道序列进行合成。其中T3SS1、T3SS2α和T3SS2β各自有4个目的基因，任何一个目的基因检测阳性，判断相应基因阳性。T3SS1包括VP1670/VP1686/VP1689/VP1694,T3SS2α包括VPA1327/VPA1335/VPA1339/VPA1362,T3SS2β包括Be ta＿vscC2/Beta＿vscS2/Beta＿vopB2/Beta＿vopC。tlh/tdh/trh、orf8、T3SS1、T3SS2α反应条件为94℃预变性3min;94℃变性30 s,45℃退火60 s,72℃延伸3 min，共35个循环；72℃延伸5 min。toxRS/new、T3SS2β反应条件为：94℃预变性3 min;94℃变性30 s,60℃退火60 s,72℃延伸3 min，共35个循环；72℃延伸5 min。
1.3 统计学分析
应用SPSS 20.0进行分析，组间比较采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 tlh/tdh/trh基因
食品来源的83株和患者来源的77株菌株都检出tlh基因，检出率为100%，确认160株细菌都是副溶血性弧菌；没有菌株检出trh,trh检出率为0。tdh基因的检出率合计为38.13%，食品来源菌株的tdh携带率（8.43%）明显低于患者来源菌株（70.13%），差异有统计学意义（χ2=64.452,P<0.05）。见图1A和表1。
2.2 orf8基因
orf8基因的总检出率为14.38%，食品来源菌株的orf8携带率（3.61%)明显低于患者来源菌株（25.97%），差异有统计学意义（χ2=16.224,P<0.05）。见图1B和表1。
2.3 toxRS/new基因
toxRS/new基因的总检出率为6.88%，食品来源菌株的toxRS/new携带率（10.84%）明显高于患者来源菌株（2.6%），差异有统计学意义（χ2=4.242,P<0.05）。见图1C和表1。
2.4 T3SS1基因
T3SS1包括VP1670/VP1686/VP1689/VP1694，所有菌株都检出了这4种基因，检出率为100%。见图1D和表1。
2.5 T3SS2α基因
T3SS2α包括VPA1327/VPA1335/VPA1339/VPA1362，总检出率为52.50%，食品来源菌株的T3SS2α携带率（19.28%)明显低于患者来源菌株（88.31%），差异有统计学意义（χ2=76.336,P<0.05）。见图1E和表1。
2.6 T3SS2β基因
T3SS2β包括Beta＿vscC2/Beta＿vscS2/Beta＿vopB2/Beta＿vopC，只有1株菌检出Beta＿vopC，总检出率为1.67%，食品来源菌株的毒力基因T3SS2β携带率（1.2%）略高于患者来源菌株的携带率（0），差异无统计学意义（P>0.05）。见图1F和表1。

图1 2017—2018年大连市两种来源的副溶血性弧菌各毒力基因毛细管电泳结果
注：M-marker;S—样本；NTC—阴性对照；PTC—阳性对照。
表1 2017—2018年大连市两种来源的副溶血性弧菌各毒力基因检出情况[株（%）]

2.7 合并分析
两种来源的副溶血性弧菌各毒力基因携带情况，食品来源菌株tdh-/trh-/orf8-/toxRS/newT3SS2α-/T3SS2β-的比例（68.67%）明显高于患者来源菌株（6.49%），差异有统计学意义（χ2=65.071,P<0.05）。两种来源菌株tlh、T3SS1携带率都为100%,trh携带率为0。此外，两种来源菌株都没有同时检出tdh和toxRS/new基因。

3 讨论

副溶血性弧菌是沿海甚至内陆地区常见的食源性致病菌，但多数菌株不致病，只有少数有毒力的菌株才会致病[1]。副溶血性弧菌由多个毒力因子共同发生作用而导致人体疾病，比较常见的毒力因子包括黏附因子、侵袭因子、溶血毒素、脂多糖、蛋白酶、尿素酶、外膜蛋白及分泌系统等，分别由相应的基因编码[2]。
tlh是副溶血性弧菌的一种特异性基因，编码TLH。TLH本身并不具有溶血活性,目前还不明确TLH是否具有致病性。所有的副溶血性弧菌均含有tlh，因此经常用该基因进行副溶血性弧菌鉴定。但是有试验发现副溶血性弧菌和溶藻弧菌的tlh基因在同源性上可达60%～70%，所以具有tlh基因能否判定为副溶血性弧菌，还需进一步检测[3]。本次分析中83株食品来源和77株患者来源的菌株均检出tlh基因，且这些菌株生化鉴定结果都是副溶血性弧菌，所以该160株菌株均为副溶血性弧菌。
tdh和trh分别编码耐热直接溶血素（thermostable direct hemolysin,TDH）和耐热相关溶血素（thermostable related hemolysin,TRH）。TDH和TRH被认为是副溶血性弧菌最主要的毒力因子，TDH具有溶血活性、细胞毒性、心脏毒性以及致死性；TRH具有溶血性和肠毒素作用。一般以有tdh和trh基因作为判定副溶血性弧菌是否有致病性的标准[4]。研究显示,绝大多数的患者来源菌株携带tdh基因,少数菌株携带trh基因,极少数同时携带tdh和trh[5]，而在外环境和食品分离株这2种基因的携带率均很低[6]。本次分析中食品来源的菌株tdh携带率为8.43%，明显低于患者来源的菌株（70.13%）；两种来源的菌株均未检出trh基因，与文献[7-9]报告的结果相似。表明食品来源的菌株独力较弱，而患者来源的菌株毒力较强。但是实验敲除tdh和trh基因后，菌株还有细胞毒性，肠毒性没有完全消除只是减弱，说明副溶血性弧菌还有其他的致病因子[10-11]。
1996年后,副溶血性弧菌出现了大流行株（高致病株03∶K6)[12]。是大片段的基因片段转移形成了新O3∶K6型菌株，如toxRS/new序列、orf8基因（位于f237噬菌体上）[13]。一般认为同时检出毒力基因tdh和toxRS/new判定为大流行株[14]；仅检出tdh或trh判定为致病株。本次分析发现食品来源菌株toxRS/new基因携带率为10.84%，明显高于患者来源菌株的检出率（2.60%）。食品来源的菌株orf8的携带率（3.61%）明显低于患者来源的菌株（25.97%），患者来源的菌株orf8的携带率低于文献[15]报告的检出率，而且两种来源的菌株均未同时检出tdh/toxRS/new,即未检出大流行株。以上说明大连市两种来源的副溶血性弧菌均不是大流行株。
Ⅲ型分泌系统（T3SS）是沙门菌、志贺菌、耶尔森菌、副溶血性弧菌等肠道致病菌的重要毒力因子，与其致病性关系紧密。所有副溶血性弧菌都有的Ⅲ型分泌系统称T3SS1，位于1号染色体上，表达的效应蛋白介导宿主细胞自体吞噬导致细胞死亡，具有细胞毒性。T3SS2与tdh和trh都存在于2号染色体致病岛（PAI）上，表达效应蛋白VopA、VopC、VopL和VopT，具有肠毒性。T3SS2又可分为T3SS2α和T3SS2β两个亚型，文献研究显示，T3SS2α存在于tdh+/trh-菌株中，T3SS2β存在于tdh-/trh+菌株中[16]。文献研究显示，环境和临床分离株均携带T3SS1[17-19]，本次分析中两种来源的所有菌株均携带T3SS1基因。食品来源菌株tdh携带率为8.43%(7/83),T3S2α携带率为19.28%(16/83),tdh/T3S2α携带率为8.43%(7/83）；患者来源菌株tdh携带率为70.13%(54/77),T3S2α携带率为88.31%(68/77),tdh/T3S2α携带率为70.13%(54/77）。可以看出两种来源菌株的T3S2α的携带率均高于tdh检出率，说明有些菌株虽无tdh基因，但是拥有T3S2α基因，即T3S2α也存在于tdh-/trh-菌株中。本次分析中两种来源的160株细菌未检出trh基因，只有1株食品来源的菌株检出T3SS2β，说明T3SS2β也存在于tdh-/trh-菌株中。
食品来源菌株不携带tdh、trh、orf8、toxRS/new、T3SS2α、T3SS2β的菌株占68.67%(57/83），而患者来源菌株该比例为6.47%(5/77），说明食品来源副溶血性弧菌毒力基因携带率低于患者来源的菌株，且患者来源菌株除tdh、trh、orf8、toxRS/new、T3SS2α、T3SS2β还可能携带其他毒力基因。
本次分析结果表明，2017—2018年大连市两种来源的菌株均不存在大流行菌株，都携带tlh和T3SS1，不携带trh；除toxRS/new外，食品来源的副溶血性弧菌毒力基因携带率明显低于患者来源的菌株。
作者声明本文无实际或潜在的利益冲突

本文由中国期刊网首发，一个权威专业的学术论文发表知识网。

文章名称：大连市两种来源副溶血性弧菌毒力基因的分析

文章地址：/fbzs/qkzs/yixue/14209.html

在线咨询快速发表

上一篇： AIDS相关肛肠疾病的研究进展
下一篇： 1976—2020年淮安市尘肺病流行病学调查

杂志社合作

十年平台，长期与1000+杂志社保持着合作伙伴关系

协议保障

可签署保密协议，不透露用户信息跟踪进程，保护个人隐私

期刊种类完备

为您提供较新期刊信息，覆盖大部分地区行业，满足您的要求

实体公司

对公企业账号，放心信任，工商部可查。注册资本金500万